干货 | CUT&Tag核心酶大解密
UT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是蛋白-DNA互作的一大革新技术，它不需要使用**交联以及免疫共沉淀，而是通过针对靶蛋白（如转录因子、染色质重塑蛋白）的抗体和Protein A/G的介导，使得与Protein A/G融合的Tn5酶(Tagmentase)在切割DNA片段的同时在序列两端加上测序接头，经PCR扩增后即可形成用于高通量测序的文库（见图1）。CUT &Tag技术具有细胞投入量低、信噪比高、实验周期短（1天实现从细胞到文库构建）、可重复性好等显著优势，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。
图1.CUT&Tag 原理图
由于CUT&Tag主要是针对极低细胞起始量进行实验，因此对核心酶原料有着极高的要求。CUT&Tag技术的核心原料酶是Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase，它具有高活性，对微量DNA有高灵敏度和高亲和力，能有效抓取数十个细胞中的有限结合位点等特点。
Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase结构
Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase的N端结构域为金**葡萄球菌A蛋白(Protein A) 的一部分或链球菌G蛋白(Protein G)一部分，C端结构域为Tn5。两个结构域通过短的刚性连接肽（Linker Peptide）连接，使得融合蛋白酶兼具PA/PG &Tn5活性。通过针对靶蛋白（如转录因子、染色质重塑蛋白）的抗体和Protein A/G的介导，Tn5 Transposase可以实现切割靶区域的目的。
图2.Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase示意图
Protein A/G
Protein A 来源于金**葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分析的Fc段特异结合的结构域。Protein G是一种源自链球菌G蛋白的细胞表面蛋白，为三型Fc受体。与Protein A类似，Protein G也可以与IgG的Fc段特异性结合，不同的是，Protein G还可以和某些抗体的Fab和F（ab’）2段结合。
Tn5转座酶
转座酶是一大类细菌来源的蛋白，通过结合转座子序列末端并催化其转移到基因组上随机位置，实现“剪切-粘贴”或“**-粘贴”型的DNA**的作用。其中Tn5转座子因其转座的随机性好、稳定性高、**位点容易测序等特点，已经成为分子遗传学及基因诊断学研究的热门工具。
Tn5转座子是一种细菌转座子，全长约5.8 kbp，由编码三个抗生素（新霉素、博莱霉素、链霉素）的核心序列和两条倒置的**50序列组成。其中**50R和**50L的序列高度同源，只是**50L的一个碱基存在突变。**50具有19bp的倒置末端（ES），外末端outside end（OE）和内末端inside end（IE），两末端倒置有7个碱基不同。此倒置末端是转座酶（Tnp）的作用位点，在转座过程中，将转座子从供体DNA中完全切除，并**到目标DNA中。**50L和**50R均含有编码转座酶（TnP）以及转座阻遏蛋白（lnh）的基因，但由于**50L中的碱基突变，造成翻译提前终止，所以仅有**50R可以产生正常的有活性的TnP和lnh。
图3. Tn5 转座子结构[1]
60 bp的转座子底物由20 bp的dbb（ ES-donor backbone，ES供体主链），19 bp的ES和21 bp的转座子组成。
图4. 60 bp的转座子底物结构[1]
Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase作用机制
Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase利用PA/PG寻找不同来源的抗体，结合在靶蛋白的附近后再进行切割。它的切割作用由Tn5转座酶实现，Tn5转座酶作用机制主要分为三步：
01：转座酶（Tnp）分子（红色）与转座元件末端与特定的19 bp ES识别序列（白条）结合，形成两个TnP-ES复合体。随后两个TnP-ES复合体通过TnP的C末相互作用进行联会，形成Tn5转座酶复合体。
02：在Mg2+存在下，Tnp活化水分子，活化的水分子进行亲核攻击，水解DNA的一条链，从而在转座子末端暴露出一个OH基团。然后激活此OH，以对DNA的互补链进行亲核攻击，形成发夹结构并切割DBB，并产生DEB复合物（具有两个切割末端的联会复合物）。每种单体都与它自己的ES（顺式接触）和与其他单体结合的转座子ES都进行接触（反式接触）。每个Tnp的催化结构域以这样的方式定位：切割另一个单体的转座子末端（反式切割）。
03：在DEB复合物与非特异性靶DNA结合后，转座子末端的活化的3′-OH基团对靶DNA进行亲核攻击，以9 bp的间隔完成链转移。Tnps离开目标DNA，缺口被修复，产生9 bp的重复。
图5. Tn5转座酶作用机制[1]
研究人员发现，整个转座子序列并不是转座必须的，只需转座子的19 bp末端核心序列，转座酶便能将该部分序列**并连接至基因组内。利用这个原理，将测序接头序列加入到末端核心序列中，在转座酶进行片段化的同时，加上了测序序列，省去了接头连接的过程，只需在片段化后进行PCR扩增便可得到完整的用于测序的文库。但是这一步之后，接头与**片段之间有9 bp的gap需要补平（如图6），这就是为什么Tn5建库在PCR之前必须进行72℃反应3min，而且所用的PCR酶需是具有链置换功能的非热启动酶。
图6. Tn5文库缺口补平
传统建库方式需要经过DNA片段化、末端修复、接头连接、文库扩增等步骤，耗时较长，而使用Tn5转座酶进行文库构建，可将DNA片段化、末端修复、接头连接等多步反应转变为一步简单的酶促反应，极大缩短建库时间，提高工作效率。
图7. 转座酶文库结构
Vazyme Hyperactive PA/PG-Tn5 Transposase优势
切割活性高
野生型Tn5转座酶的活性很低，以减少对宿主产生致命突变的风险。Tn5转座酶活性很低的部分原因在于其蛋白的N端和C端在三维空间构象上相互接近，并发挥相互抑制的作用。诺唯赞专注于酶改造，使用基因工程手段对于N端或C端的突变，可以得到高活性形式的突变形转座酶。使用Vazyme pA-Tn5与市面上A公司同类产品使用50 ng gDNA 在55℃条件下打断10 min后，扩增9个循环，利用Qubit检测浓度比较转座酶活性，发现Vazyme PA-Tn5切割活性远远高于A公司同类产品。
图8. Vazyme pA-Tn5与A公司同类产品产量比较图
核酸残留低
由于Tn5转座酶对DNA有极高的亲和力，导致了纯化过程中易产生非特异核酸残留。Henikoff实验室设计不同投入量细胞进行CUT&Tag实验，并分析不同投入量下E.coli残留情况。发现随着细胞投入量下降，E.coli reads 越多。
图9. 不同细胞投入进行CUT&Tag实验得到的目的reads与E.coli残留结果展示[2]
诺唯赞生物针对Tn5酶非特异性核酸残留问题进行攻克（见图11），优化酶生产工艺，大大降低了低起始量细胞建库中非特异核酸占比。
图11. pA-Tn5核酸残留与公司核酸残留比较
核酸残留检测方案：实验人员使用PA-Tn5裸酶进行PK消化，富集并回收核酸。设计针对细菌23S通用qPCR引物，对回收的核酸进行qPCR检测，计算E.coli核酸残留。
过去三年间，北大清华等多所高校院所使用诺唯赞Tn5转座酶发表的高影响因子文章14篇，其中CNS有7篇。其中2020年1月13日，北京大学**生物医学研究所尹玉新课题组在国际免疫学领域**期刊Nature immunology在线发表了题为The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity 的研究**，揭示了磷酸酶PAC1作为T淋巴细胞功能抑制因子，可以减弱宿主细胞免疫监视功能，促进肿瘤免疫逃逸的作用机制。该文章使用了Vazyme Tn5转座酶（TD501）进行ATAC-seq实验以及PA-Tn5（S603）进行CUT&Tag实验。
参考文献：
[1] Vaezeslami S , Sterling R , Reznikoff W S . Site-Directed Mutagenesis Studies of Tn5 Transposase Residues Involved in Synaptic Complex Formation[J]. Journal of Bacteriology, 2007, 189(20):7436-7441.
[2] Hatice S, Kaya-Okur, Steven J,等. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of **all samples and single cells.[J]. Nature communications, 2019.
[3] Lu D , Liu L , Sun Y , et al. The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity[J]. Nature Immunology, 2020, 21(3):1-11.
一 公司基本情况速览总股本：1.879亿 总发行量 :4690万 发行**：10.69元 募资总额：5.01亿发行市盈率:20.42倍 行业市盈率:19.12倍所属行业：燃气生产和供应 所属区域：陕西
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